❶ TCR基因修饰的细胞毒性T淋巴细胞构建
细胞毒性T淋巴细胞（CTL）是机体抗肿瘤和抗病毒感染的关键效应细胞，CTL通过T细胞受体（TCR）特异识别靶细胞表面MHC-I 与抗原多肽形成的复合物，进而释放穿孔素、颗粒酶等生物活性物质对靶细胞进行溶解。鉴于CTL在治疗肿瘤和病毒性疾病中的潜在作用，对CTL的基础与应用研究备受关注，大多研究集中于对TCR基因的改造。随着分子生物学的发展，TCR基因克隆、转导技术已较成熟，研究方向主要是如何保证TCR基因高效、正确表达组装成为具生物活性的分子。 机体免疫防御主要由体液免疫与细胞免疫两大系统构成，其中以CD8+T淋巴细胞介导的细胞免疫在抗肿瘤过程中发挥重要作用。CD8+T从静息性T细胞活化为具有特异杀瘤作用的细胞毒性T淋巴 细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL)经过如下3个关键步骤：第一步是抗原加工与提呈，主要由专职抗原提呈细胞树突状细胞（dendritic cell, DC)负责; 第二步是识别与活化，CD8+ T细胞通过其表达的T细胞受体(T cell receptot, TCR)特异识别DC提呈的MHC-Ⅰ-多肽复合物，接受T细胞活化的第一信号，DC表面丰富的免疫共刺激分子给予T细胞活化的第二信号;第三步是识别与杀伤，活化的CTL通过TCR特异识别瘤细胞表面MHC-1-多肽复合物，释放穿孔素和颗粒酶等生物活性物质溶解瘤细胞，或通过Fas-FasL途径诱导瘤细胞凋亡。CTL的TCR对肿瘤抗原的识别是发挥其效应的基础，抗原识别的特异性取决于TCR结构的多肽性。越来越多的研究小组利用现代分子生物学技术克隆能识别特定抗原表位的TCR基因，构建TCR基因病毒载体再转染外周CD8+ T细胞，将之修饰成为能识别特定靶抗原的CTL。体外大规模扩增经TCR基因修饰的CTL，将为肿瘤及传染性疾病提供新型、特异的治疗手段。 TCR是T细胞表面能够特异性识别抗原表位和介导免疫应答的分子，TCR的多态链依编码基因不同命名为α、β、γ、δ链，分别形成αβTCR和γδTCR。 人外周血中约95%为γδTCR，约5%为αβTCR。 TCR分子是由两条糖基肽链通过二硫键组成的异二聚体。所有α、β、γ、δTCR肽链均可分为胞外、 跨膜(TM)和胞质(Cy)3部分。胞外部分又分为可变区（V）、高变区（D）、结合区（J）和恒定区（C）。α链 由V、J、C基因编码，β链由V、D、J、C基因编码。两链不同区域等位基因的重排决定了TCR的多态性，赋予了T细胞识别不同抗原的巨大潜力。TCRα和β肽链可变区存在4个氨基酸高变区（hypervariable region, HVR），亦称互补决定区（complementarity determining region, CDR），其中CDR1、CDR2，CDR3又称为超变区，是抗原特异性结合部位。TCR多态性主要由CDR3决定。 克隆TCR基因的关键是分离到具有高亲和力的识别抗原肽的T细胞克隆。已经有多个课题组利用不同技术从不同来源获得CTL克隆。Morgan等从黑色素瘤患者的肿瘤浸润性淋巴细胞中分离出能识 别MART-1抗原表位的T细胞克隆。Zhang等从慢性丙型洞誉肝炎患者外周血中分离得到HCV特异性的CTL克隆。Morgan等运用HLA-A2限制性多肽体外致敏预先免疫该多肽患者的外周血淋巴细胞 （peripheral blood lymphocyte, PBL），然后用有限稀释法获得CTL克隆。Varela-Rohena等运用噬菌体展示技术分离抗原特异性TCR。利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）、反转录PCR （reverse transcription PCR，RT-PCR）技术克隆上述TCRα、β链全长基因。利用基因扫描技术对TCR CDR3区域进行分析，了解其可能存在的亚家族。 Meyerhuber等运用此方法从HER2(369-377)特异性CTL中成功克隆了TCR基因。 目前在TCR基因转染过程中报道较多的是运用逆转录病毒载体。逆转录病毒载体有多方面优势，感染细胞范围广，不仅适用于单层培养的细胞，而且适用于悬浮培养的淋巴细胞;机体对渗粗载体产生的免疫反 应较低，在宿主内可以稳定遗传;往往以低拷贝整合，避免了基因重排;经特纳喊段殊构建的反转录病毒载体是缺陷型的，比较安全;选择不同的外壳蛋白进行包装，可赋予病毒特定的宿主选择性，从而达到靶向导入的目的。 Morgan等从黑色素瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）中获得能识别 MART-1抗原表位的CTL克隆，从中克隆到TCR基因，利用逆转录病毒载体将该基因转导入至人外周血 T淋巴细胞，经体外扩增后治疗17例Ⅳ期黑色素瘤患者，15例患者在治疗2个月后循环T细胞数量至少增加了10％，2例患者病情得到控制，在18个月内未复发。Parkhurst等将癌胚抗原（carcino-embry-onic antigen, CEA）特异性TCR构建入逆转录病毒载体转导人外周血淋巴细胞，在TCRα链CDR3区域引入单核苷酸突变，增强了TCR的亲和性。临床试验对3例转移性结直肠癌患者进行治疗，结果所有病例血清CAE水平均有所下降（74％~99％）。 目前较常用的逆转录病毒载体为Moloney小鼠白血病病毒改构的各类逆转录病毒载体，理论上它能转染几乎100％的靶细胞，但实际的转染效率远低于此。近年来人们通过各种改良方法不断提高逆转录 病毒载体转染效率。Yang等运用高速离心法浓缩病毒，4℃，6000rpm，过夜，可使病毒滴度提高50~100倍，进而提高转染效率。研究人员利用逆转录病毒载体将TCRαβ基因转导人初始T细胞,发现在相同的病毒滴度下，以骨髓瘤病毒（myeloproliferative sarcoma virus,MPSV）或鼠干细胞病毒（murine stem cell virus, MSCV）为基础载体比以小鼠白血病病毒（murine leukaemia virus, MLV）为基础的载体有高转染效率和高TCR表达。 改良的逆转录病毒载体已被多个研究组用于不同肿瘤相关抗原特异性TCR基因转移中。但逆转录病毒只能感染分裂期细胞，容纳外源基因的DNA片段长度不超过8000bp，病毒滴度低，有的反转录病毒可能具有激活癌基因的危险。 慢病毒载体其优点在于可有效转染分裂和未分裂细胞;能稳定整合到靶细胞的基因组中;可转移约 8000~10000bp基因片段;能持久稳定表达外源基因，不易导致基因沉默;没有整合位点偏好性。 Yang等将识别MART-1和gp100的TCR基因重组入VSV-G假型第3代慢病毒载体，转染外周T细胞，转染细胞出现了特异性抗瘤活性，包括释放γ干扰素和溶解瘤细胞。2010年该课题组运用CD3抗体和PBL饲养细胞预刺激T细胞，明显提高T细 胞转染效率，12 d内CD8+ T细胞数量扩增达600倍，且具有特异性杀伤活性和记忆性。Stauss等对比逆转录病毒载体与慢病毒载体转移WT-1特异性TCR研究表明，慢病毒载体相对比较安全，可获得较高转染效率。Canderan等设计了杂合非小细胞肺癌特异性TCR，该TCR是由人TCRV区和鼠TCRC区嵌合而成，后将该TCR构建入慢病毒载体转导T 细胞前体，产生特异性CD4＋ CD8＋可稳定表达杂合TCR，T细胞体外增殖良好，并可特异性识别非小细胞肺癌。虽然慢病毒载体有较多优势，但存在有毒力恢复、垂直感染等潜在的安全隐患，仍需要临床更多的深入研究。 将外源基因直接用理化方法转导入靶细胞。常用的转导方法有电穿孔技术、磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、显微注射法等，其对外源基因片段大小无要求，安全性很高，但转染效率很低。 TCR基因转染的载体主要还是病毒载体，但研究人员一直都在尝试寻找更理想载体系统。值得一 提的是，“睡美人”（sleeping beauty, SB）转座子系统已被应用于TCR基因转移过程中，Peng等报道， 该方法TCR转导效率可与病毒载体相媲美，但该系统缺陷在于存在整合位点偏好性，这将是其应用于临床前亟待解决的问题。 研究人员将TCRα和β两条链分别构建入两个独立病毒载体中，因为编码CR单链基因的小病毒载体容易包装，可获得较高的病毒滴度。但为了得到功能性的TCR，含有α和β两条链的两个病毒颗粒必 须同时转染同一个T细胞。这种双感染容易增加插入突变的风险，此外，引入TCR单链易形成内源与外源TCR链的杂合体。Dossett等用不同的启动子来调控TCR两条链的表达，其中TCRα链受控于一 个长末端重复序列（long terminal repeat, LTR）元件，该元件也驱动报告基因neo的表达，TCRβ链的表达由杂合HTLV-I/SV40启动子SRα来驱动。该方法易受启动子的干扰，导致TCR表达下调。Wang等将HC/2G-1 TCR两条链由一个内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）原件连接，在一般启动子启动下作为一个单一转录盒来表达。IRES原件可以保证TCR两条链同时表达，但IRES5′端基因通常较3′端基因表达量高，会导致突变的发生。 Chinnasamy等将TCR基因两条链通过一个源自 微小RNA病毒的肽原件2A（2A peptide, p2A）来进行连接。这种连接方式可以产生一条单一的编码TCRα和β链的mRNA。翻译时，核糖体可跳过2A肽序列，从而产生两条单独的肽链：TCRα-2A融合蛋白和甘氨酸TCRβ，这种连接方式可以等量表达TCRα和β链，此外肽序列要比IRES原件短，构建的病毒载体较小，容易包装，可获得较高病毒滴度。 TCR组装和表达是一个复杂的过程，在细胞表面进行表达之前，TCRα链和β链首先形成异源二聚体，然后与CD3复合物在内质网结合，最终TCR CD3复合物由内质网释放后转移至细胞膜，在这个过程中会有诸多因素影响TCR的表达效率。 密码子优化是指用人类基因组中常见的同义密码子置换非常见密码子。已有证据表明，密码子优化的TCR基因在转导T细胞中表达水平比野生型TCR基因有所提高，从而增强其体内功能。但是，密码子优化可能产生免疫源性TCR，此过程也可能会伴随多肽序列的改变产生另一种开放读码框，有一定风险。 TCR基因转移载体构建时最好使用单病毒载体，可以同时编码TCRα链和β链，这样可以防止插入突变和转导T细胞仅表达引入的1条链，可以减少引入链与相应内源性TCR链误配的风险。如果存在TCR其中1条链供应不足的情况，会削弱TCR异源二聚体的聚合细胞表面表达。近年来，研究人员运用IRES序列或者P2A，连接TCRα链和β链构建载体，很大程度上克服了载体配置造成的两条链表达不均衡的问题。 有效的细胞表面TCR表达需要稳定的TCR CD3复合体构建。没有CD3的情况下，TCR不能聚合而被降解。因此向T细胞内引入外源性TCR时，CD3分子的存在是主要限速步骤。竞争可降低引入性TCR细胞表面表达。 引入性TCR的表达水平通常比内源性TCR低，内源性TCR可以削弱转导T细胞对低浓度TCR识别抗原的反应活性，这一结果验证了引进TCR与内源性TCR竞争有限的CD3分子。 Sachiko等通过小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）的表达使内源性TCR沉默以提高外源性TCR基因的表达和活性。最近研究表明，带有编码TCR α和β链基因载体与另一个编码CD3γ、δ、ε、ζ基因的载体进行双重转导CD8+T细胞，可以提高CD8+T细胞活性。 有研究表明单独α或β链转导T淋巴细胞可导致外源性TCR链和内源性TCR链混合二聚体的形成。外源性TCRα或β链与内源性TCRα或β链的误配导致目标TCR自身配对减少，从而影响TCR的亲和性。此外，误配二聚体的形成可能会导致自身免疫反应等安全问题。Thomas等将TCR恒定区鼠源化，或进行半胱氨酸修饰产生分子间二硫键，发现均可提高外源性TCRα和β链的正确配对。 Voss等在TCRα和β链恒定区插入一对相互作用氨基酸，改变TCR恒定区二级结构（从“knob-into-hole”构象变为“hole-into-knob”）来提高两条链的正确配对。 尽管目前TCR基因修饰CTL的基础与临床研究均取得较好进展，但仍存在一些问题，如功能性TCR的正确表达、TCR表达效率、TCR基因修饰CTL的亲和力与体内有效性和存活时间、临床安全性等均需要深入研究。
❷ 为甚么人老后会死
老死的原因是因为我们的细胞老化至不能自我复原或不能再次分裂新细胞，新阵代谢率降至非常之低，直至细胞死亡。 或者你会进一步问，为什么细胞会老化 究竟人的寿命及细胞老化有何关系? 答案就在我们的DNA*之中(DNA又称去氧核糖核酸，共有23对染色体 是一种分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作) 好像太深了 其实可以简单点说 我们的成长就是全靠DNA作出细胞分裂指令 你每条DNA后面都有一段东西 每次DNA分裂时都会自动减短 若不计意外之死亡 那么 DNA就不断分裂 那段东西就愈用愈短 最后DNA那段东西用完了便不能再次分裂了 这就是为何有些细茄野运胞会衰老的原因。 世界上所有生物都是由细胞组成，细胞是十分重要的，因为细胞内储存了很多种不同的颤梁资料。有些细胞如果受到损害，它们会自动复原，但另一些细胞是不会复原的，例如脑细胞；当细胞不能复原，细胞所属的器官便渐渐会失去功能。在这情况下，身体便不能正常地运作，功能会慢慢衰退而死亡。 人类死亡有两大原因：疾病和退化。外来因素如细菌会损害人类体内的细胞，如果细胞不能复原，那部分器官便开始失去它的功用（身体内每个器官都有它独特的功能），这样便会影响整个身体的正常运作。如果身体不能正常运作，我们便会死亡。 另外一个因素是细胞退化，每个细胞都知道它们的寿命，这个现象称为Program Death，当细胞运作一段时间后，细胞便开始疲劳、衰退以至死亡。这时脊渣候器官慢慢失去功能，这样我们便会退化而死。 其实世界上任何一种生物都会死，不过有不同的寿命，有些是短短的一两天，有些可长达百年多，但是最终都会死亡。 因为主控生命成长成熟的遗传基因发育已经饱和 已经好比果实一样的熟透了! 加上人就是因为会死 地球人资源才尚且可以充裕地给予人类活命同使用 否则一早已经耗尽了! 如果人不会死的话 牛顿𠮶个时代的人口总和同现在地球人口同将来世世代代人口加加埋埋 真系难以想像的大大镬 人口密度大到难以想像的大大镬! 虾就算不被人果腹 亦会老去! 人即使唔会死 亦有意外致命! 如果人不会死 啲物质生活好理想的富豪 亦有工人代努 而他们暗中的黑心所为同自私行为 即使引致他人反抗他 他们亦有真正聪明的大只保安保护同种种的可免除一切致命危机情况出现等等 而人人的遗传基因的优秀程度又有不同 咁世界仲比依家更更唔公平! ….如果人不会死的话 坏人们 又点会恶有恶报! 如果坏人坏得有钱起来 咁就可以更坏啦!咁多坏人 监狱可以容纳超多人吗?系咪想个个国家都要有死刑呀? 参考: 你唔见BB大得好快嘅咩? .myblog.yahoo/dionysos113/article?mid=1480 .myblog.yahoo/dionysos113/article?mid=103 .myblog.yahoo/dionysos113/article?mid=73 2011-03-08 09:47:20 补充： 八戒： 当你发咗达，做咗皇帝，就唔想死．．．．想好似我咁，返老还童。 因为身体机能下降 容易有大病 because 生老病死!!!! 参考: the teather teach
❸ 网络星期一的DNA测试：以下是这些测试可能告诉你的
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最初发表在《生命科学》杂志上
❹ 看了这些书架设计，才知家里的有多out！
心爱的书当然得给它找一个最好的书架，这些是设计师们精心设计的书架有你喜欢的吗？不仅仅可以给你心爱的书本一个容身之处，还分分钟提升房间的艺术感！1Superman经典标志，除了书还能够放一些装饰物，珍藏的模型等等，粉棚肆薯丝们怎么能错过这个。2用钢架，木头和金属丝制作而成的书架，让你的书“悬浮”在空中，如果你的藏雹颂书量相当客观，大概只能选几本最爱放在这里了。3便携可移动书架，只需要一个有挂钩的地方，它就可以给书本杂志一个家。卧室床头，办公室，甚至是在厨房，随时随地hold住你的书。4酷似女性的面部的书架，多个隔断满足大量书籍和装饰物的摆放，不同颜色搭配不同室内装修风格，组装起来难度也不大。5DNA造型的书架MYDNA，它的设计师表示，就像DNA决定了我们每个人与生俱来的特点一样，放在MYDNA书架上的书可要精心挑选哦，它们足够展现一个人的个性。6像雨滴下落一样的书架，书本就藏在这些拐角处，没有规律的摆放方式让它像更一件绝妙的艺术品。7云朵造型的书架，有四种放置方式，至于中间如何隔断，全靠你的想象力了。8这是茶几吗？当然不。这款书架，既可以将书挂在横栏上，也可以直接将书放在上面，底座也是很链者棒的收纳处。9挂在墙上的书架，一端放书，另一端放植物，为墙壁多添一丝生气。10在墙上快要飞起来的书架们…11从地下“长”出来的书架们，它们会不会成为你最喜欢的树呢？12几何元素完美融入的书架们。
❺ ATAC-seq应用案例解析
真核生物中，DNA缠绕在组蛋白八聚体上形成染色质的基本结构单位——核小体，进而高度折叠形成染色质，最终被包装入细胞核中。高度折叠的染色质结构对其包装进细胞核纤誉枣是必要的，然而DNA的复制和转录等过程都需要打开染色质的紧密结构。染色质开放性可以反映出染色质转录活跃程度及结合的其他DNA修饰信息，特定条件下的染色质开放性变化可以提供大量的基因表达调控信息，为蛋白结合新位点的研究提供了方向。 文献案例 研究背景：成人心脏是一个低再生潜能的器官。急性心肌梗死后的心力衰竭是心肌细胞不能增殖和补充丢失的心肌而导致的主要死亡原因。虽然斑马鱼已经成为研究内源性心脏再生的有力模型，但心肌细胞通过分解肌节、增殖和重新填充受损区域来应对损伤的分子机制尚不清楚，对其染色质景观和表观遗传障碍的调节还不了解，而必须克服这些障碍才能使心脏再生发生。 研究方法：作者利用ATAC-Seq首次发现在冷冻损伤后，再生心肌细胞染色质可及性格局发生了广泛的变化。通过生物信息学和基因表达分析，发现AP-1结合位点是心脏再生过程中获得可及性区域中含量最高的基序，并使用特异性显性负性方法，发现阻断 AP-1 功能导致了心肌细胞增殖缺陷，以及 fbxl22 和 ilk 位点染色质可及性的降低，并利用RT-qPCR及TF足迹等实验及分析证实这两个靶基因分别调节肌节的分解和心肌细胞向损伤区域的突起。此外，研究还通过进一步实验证明过表达AP-1家族成员 Jun b 和 Fosl1 可以促进哺乳动物虚扰心肌细胞体外行为的改变。 研究结果： 1. 心肌细胞染色质可及性景观在再生过程中发生重大变化 利用ATAC-seq技术对再生心肌 Tg （gata4： EGFP +CMs） 及未损伤细胞 T g (myl7：nucDsRed) 进行分析，对鉴定出的差异上、下调peak相关基因进行GO分析发现：上调peak相关基因在调节生物过程中富集，如细胞迁移、调节细胞对刺激的反应和细胞骨架组织；下调peak相关基因则在肌原纤维组装等生物过程中富集。再生心肌细胞染色质可及性更高的基因区域的KEGG分析揭示了参与PDGF、Wnt和整合素信号通路的基因富集。因此作者认为染色质可及性变化很可能是激活多个基因和信号通路的先决条件，而其中一些先前已被证明与斑马鱼心脏再生有关。 为了确定可能招募染色质重塑酶以控制CM中染色质景观的转录因子，作者对上调的peak区域进行了转录因子基序分析，并结合分析之前已发表的斑马鱼在冷冻损伤后多个时间点的RNA-Seq心室的数据及RT-qPCR结果，发现多个 j un / f os 基因（AP-1 转录因子家族）响应成人心脏的CMs冷冻损伤而上调。通过TF足迹对比分析小鼠ATAC-Seq数据发现：在斑马鱼CMs中表达的AP-1家族成员（ junba / bb和 fosl1a ）在心肌梗塞后的小鼠边界区CM 中没有高度表达或上调。 2. AP-1对于斑马鱼心脏再生是必需的 由于在CMs再生过程中有多个 jun/fos 基因的表达，作者利用显性负转基因系，以组织特异性的方式抑制所有AP-1转录因子的功能（研究表明显性阴性基因 A – F os 在多种情况下都能抑制AP-1转录因子的功能），并结合免疫染色及PCNA/Mef2联合免疫染色方式的结果，最终认为：AP-1转录因子功能对于CM的去分化和增殖以及随后的瘢痕消退是必需的，在CM再生中起关键作用并调控CM的关键过程，包括肌毁拆节解体和CM突入损伤区域。 为了鉴定导致CM:A-Fos(+)心脏不能再生的靶基因，作者进行了再次的ATAC-Seq分析，结合转基因品系样本和RT-qPCR 结果，认为：AP-1转录因子可促进未受损CMs中染色质可及性的变化，与再生CMs相似。 3.推测AP-1靶基因 fbx122 可促进心肌细胞肌节的解体 通过对数据的分析，作者鉴定出AP-1的可能靶基因 fbxl22 ，并通过RT-qPCR证实了其表达上调；TF footprint IGV可视化发现：相较于CM：A-Fos(-)CMs，CM:A-Fos (+) CMs中保护DNA不被转座酶切割的保护作用减弱，与AP-1结合的丧失有关。结合实验验证，发现 fbxl22 是AP-1转录因子的靶点，进一步实验研究表明 fbx122 在斑马鱼CMs 中的过度表达可以促进肌节蛋白降解。 4.推测AP-1靶基因 ilk 可促进心肌细胞向损伤区突起 作者在数据分析假定的AP-1靶基因，整合素连接激酶( ilk ) ，并通过RT-qPCR及TF 足迹分析证实 ilk 是AP-1靶基因，可促进心肌细胞向损伤区域突起，并通过进一步实验验证AP-1转录因子可以调节哺乳动物的心肌细胞行为。 5.JUNB和FOSL1可以调节哺乳动物心肌细胞(CM)的行为 为了确定AP-1转录因子是否也能调节哺乳动物CM行为，作者利用 GFP、Junb、Fosl1、Junb+Fosl1 mRNA分别转染原代大鼠新生儿心肌细胞培养物，结合RT-QPCR、免疫印迹和免疫染色及验证实验，发现在哺乳动物CMs中，心肌梗塞后通常不上调或高表达的AP-1家族基因 Junb+Fosl1 的过表达导致了CMs行为的改变，这与斑马鱼CMs再生过程中发生的行为变化相似（包括CM增殖和CM突出）。 结论：AP-1 转录因子通过调节染色质可及性改变，从而激活促进心肌细胞去分化、增殖和突入损伤区域的基因表达程序，在心肌细胞损伤反应中发挥重要作用。
❻ 黑芥子酶 拟南芥芥子酶基因TGG6是花特异表达的假基因
摘 要：芥子酶是一类催化硫代葡萄糖苷水解的同工酶，TGG6是在拟南芥中新发现的芥子酶基因，从拟南芥几个不同生态型中克隆了TGG6基因的全长核基因和cDNA片段，序列分析结果表明，所有供试的生态型的TGG6基因都与拟南芥第3个芥子酶基因TcC3类似，在编码区存在1个以上移码突变，不能编码完整多肽。生态型Col-O第10个�含子的剪切边界还发生了缺失，导致内含子不能被切除，初步确定TGG6是一个假基因，然而，RT-PCR结果却表明TGG6在花器中特异性表达，说明TGG6在进化的掘灶某个阶段可能是有功能的基因，由于某种原因，该基因在进化过程中被失活。 关键词：拟南芥：芥子酶；TGG6；组织特异表达；花特异表达；假基因 中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：1007-7847(2007)04-0316-07 随着更多物种基因组测序计划的展开或完成，人们对假基因的概念及其意义有了更新的思考，并成为基因组学研究的一个热点，假基因(pseUdogene)被定义为核苷酸序列与相应正常功能基因相似的，但不能合成功能蛋白质的失活基因，假基因最初由jacq等人提出。他们在非洲爪蟾DNA中克隆了一个5S rRNA相关基因，在与其相应功能基因比较后发现，这个基因的5′端有16bp的缺失以及14bp的错配，不具有正常5S rRNA的功能，因此，将这个截短的5SrRNA的相关基因描述为芦简假基因，随着人类基因组计划的完成和后基因组计划的实施，对占人类基因组约90％的非编码序列的研究已经展开，预计人类基因组中有约20000种假基因，在线陪散裤虫、果蝇以及酵母等生物中也发现大量假基因，假基因保留了祖先功能基因的残余拷贝，为研究生物进化和基因组动态变化，分析基因复制与突变等事件的年代以及频率，揭示基因组DNA替换、插入和缺失等事件的机制提供了重要线索，此外测定假基因的分布可为新基因的预测以及鉴定提供更好的帮助。 芥子酶(myrosinase，EC3.2.1.147)是一类硫代葡糖苷酶，主要分布在白花菜目植物中，专一降解硫代葡糖苷，芥子酶和硫代葡糖苷分别储藏在不同的细胞中，当植物受到昆虫或病源伤害时，芥子酶将硫代葡萄糖苷水解为异硫氰化合物、硫氰化合物、腈或(口恶)唑烷硫酮等有毒物质，抵御病虫侵袭，因此认为“芥子酶／硫代葡萄糖苷”系统是植物重要的防御系统，目前已在15个科500多种双子叶植物中检测到芥子酶活性，其中，对十字花科作物的芥子酶研究得较多，油菜和白芥等作物的芥子酶基因家族由MA、MB、MC 3个亚家族组成，共20多个基因，其中部分基因已被证实为假基因”。 在拟南芥中，最初认为只有3个芥子酶基因，其中第3个基因TGG3被证实为花特异表达的假基因，由于3个基因都不在根中表达，人们却检测到根提取物的芥子酶活性，因此推测存在更多的芥子酶基因，2001年Nitz等分离到一个根特异表达的葡萄糖苷酶基因Pyk10，由于与芥子酶基因相似性高，认为是芥子酶基因，但是由于没有酶活性测定证据，而且Pyk10不具备芥子酶关键特征位点，因此Pyk10不一定是芥子酶基因，通过Blast分析，我们发现了3个序列高度相似的基因具有芥子酶基因的特征，分别命名为TGG4、TGG5、TGG6，其中TGG4、TGG5在根部特异表达，酵母表达产物具有芥子酶活性，证明是芥子酶基因(待发表)，TGG6在DNA序列上与TGG4和TGG5高度相似，但是在根部检测不到表达。使用TGG4和TGG5的cDNA序列与GenBank中的TGG6基因组DNA序列比对，个别内含子的剪切边界很难确定，因此难以断定TGG6是否是有功能的基因，本研究同时从拟南芥几个生态型克隆了TGG6的核基因和cDNA，通过生物信息学分析，发现TGG6存在移码突变和内含子剪切边界的突变，不能合成有功能的芥子酶，具有假基因的特征，因此推测TGG6是一个假基因。 1材料与方法 1．1拟南芥生态型和种植方法 本实验所使用的生态型Col-O、Ba-O、Ws-O来自Nottingham Arabidopsis Stock Center，England，JM1、JM2由作者实验室收集保存，种子播种在标准营养土上，4℃放置3d后转到培养室培养，培养室温度20℃，光照16h/d，光照强度5000lx， 1．2总DNA的提取和，GG6基因的克隆 取拟南芥5种生态型植株的叶片，液氮研磨，采用大连宝生物公司总DNA提取试剂盒提取总DNA，以基因特异引物G6F1(5′-ACCCGCTGAAAAGCTCCATCAA-3′)，G6R1(5′-GGCTYCCACTYATITYGCAATGAACC-3′)扩增TGG6基因组DNA，引物由上海闪晶生物公司合成，DNA聚合酶LATaq来自大连宝生物公司，PCR产物克隆在pMD-19T载体中，转化大肠杆菌(E.coli)DH5α，酶切鉴定后，由上海闪晶生物公司测序，每个生态型TGG6基因至少测3个克隆，以排除PCR错误对序列的影响。 1．3RNA提取和反转录 分别取新鲜的拟南芥根、茎、叶、花、子叶和绿色角果约50mg，液氮迅速研磨，加入500μLTrizol试剂，剧烈震荡，按照上海申能博彩公司的3S Trizol T0tal RNA Isolation Kit试剂盒说明书进行提取，电泳检测各样品的总RNA质量和浓度，以5μL RNA为模板，合成第一链cDNA，按照上海生工AMV第一链cDNA合成试剂盒说明书的方法进行，eDNA的合成过体系如下：在一个Eppendorf管中，加入各个组织的总RNA 5μL，oligo(dT)lμL，RNase-Free H2O 6μL，轻弹混匀离心后置于70℃变性5min，立即取出放置冰上30s，然后加入以下试剂：缓冲液4μL，dNTP 2μL，RNase inhibitor 1μL，轻弹混匀离心后37℃反应5min，再加入AMV反转录酶1μL，37℃水浴1h，70℃/10min终止反应。 1．4TGG6基因在拟南芥各器官组织中的表达分析 以上述第一链cDNA为模板，用半定量PCR方法扩增TGG6 cDNA，在基因转录水平探讨JPTGG6基因在拟南芥植株中的表达情况，PCR反应体系(50μL)：拟南芥cDNA 100ng(1.5μL)，dNTP 4μL，10×PCR buffer 5μL，上游、下游引物G6F1、G6R1各1姓，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 37μL，反应条件如下：95℃，2min；94℃，30s，56.3℃，45s，72℃，1min 30s，30个循环； 72℃，7min结束反应，以Actl基因的表达作为参照，Actin基因的引物序列为：5′-GGCAAAAGGATGCTFATGTTGG-3′，5′-ATITCACGCTCTGCTGTGGTGG-3′，反应结束后取5μL进行电泳检测，照相。 PCR阳性的产物纯化后，连接至pMD-19T载体，进行蓝白斑筛选挑取阳性克隆，酶切鉴定后送上海闪晶生物公司进行序列测定。 2 结果与分析 2．1生态型Col-O的TGG6基因的失活突变 植物芥子酶基因一般都由12个外显子和11个内含子组成，TGG4和JP7GG5代表一个芥子酶基因新家族，其基因由13个外显子和12个内含子组成(待发表)，TGG6基因序列与TGG4和TGG5相似型较高，基因结构也相似，由13个外显子组成，不过，将生态型Col-O的TGG6核基因序列、cDNA序列与TGG4、TGG5基因序列比较发现，在TGG6中存在4个移码突变，包括第1个外显子中2个碱基的插入突变、第6个外显子中1个碱基的插入突变、第9个外显子中4个碱基的缺失突变以及第12个外显子中17个碱基的缺失突变(图1)，这些突变都使TGG6基因不能编码正确的芥子酶，此外，Col-0的TGG6基因的第10个内含子的3’端剪切边界区域发生9个碱基的缺失突变(与TGG4比较)，导致第10个内含子保留在cDNA中，未被剪切。有趣的是，TGG6第10个内含子的5′端的剪切边界与JP7GG4和JPTGG5-样，是一个异常边界“GC”。 2．2 TGG6在花中特异表达 以拟南芥生态型Col-O为材料，从不同器官中提取总RNA，结果如图2所示，由图2可以看出RNA条带整齐，完整性良好，可以满足后续试验的要求。 说明第6个外显子的插入突变是TGG6基因最早发生的基因失活突变，它发生在拟南芥生态型分化之前，而其它位点的突变发生在JMl、JM2与Col-0等生态型的分化之后。 RT-PCR结果(图3)表明，TGG6基因在花中特异表达，在子叶、根、茎、叶和角果中都检测不到表达。 2．3 不同生态型TGG6基因的克隆及多态性分析 分别从Col-O、JMl、JM2、Ws-O、Ba-O等拟南芥生态型克隆TGG6基因组DNA和cDNA，测序后进行序列比较，结果发现，生态型Ws-O和Ba-O与Col-O序列相似性接近100％，具有Col-O的所有移码突变以及第10个内含子的剪切边界缺失，但生态型JMl和JM2仅具有第6个外显子的1个碱基的插入突变，其它突变位点都正常(表1)。 3 讨论 在过去的几十年中，假基因一直被认为是分子化石，是进化中基因突变的遗迹，没有功能，属于“垃圾基因”，与相应的正常基因相比较，假基因缺少正常基因的内含子，两侧有顺向重复序列等，大多数假基因本身存在着多种遗传缺陷，例如早熟终止密码以及移码突变等等，因而它们的表达受到了抑制，但是近来科学家发现假基因并不是“垃圾基因”，假基因在基因表达、调控以及产生基因多样性等方面可能都扮演着极为重要的角色，但到目前为止，其确切的作用机制仍不清楚。 目前已在拟南芥中发现6个芥子酶基因即TGG1、TGG2、TGG3、TGG4、TGG5及TGG6(TGG4、TGG5及TGG6未发表)，其中TGG1、TGG2、TGG4、TGG5已被证实是有功能的基因，TGG3是不能编码完整芥子酶的假基因，本研究通过对5个拟南芥生态型TGG6基因的序列、结构和表达研究，发现TGG6基因在所有5个生态型中都存在第6个外显子的插入型移码突变，导致基因不能编码完整的芥子酶，因此认为TGG6与TGG3一样，是一个假基因，由于TGG6在基因序列中存在TGG4和TGG5中的所有内含子，TGG6是在基因重复发生后，再通过失活突变而形成的，然而，与TGG3一样，TGG6也在花中特异表达，而且TGG6在所有生态型中所共有的移码突变发生在第6个外显子，与TGG3在所有生态型中所共有的移码突变(第5个外显子)的位置非常接近(图4)，这种现象到底是必然还是巧合有待进一步研究。 TGGI3由12个外显子组成，TGG4-6由13个外显子组成，其差别来自在TGGl―3中的第5个外显子在TGG4-6中被1个内含子分割为两个外显子，TGG6和TGG3的表达特征与TGGl和TGG2在叶片、子叶、茎、花和角果中表达，TGG4与TGG5在根部表达形成鲜明的对比，这些信息暗示TGG6和TGG3可能还有某种未知的功能，另外，由于TGG6和TGG3的突变发生在基因重复之后，在进化的历史上是否还残留着功能基因，并保存在某个地区的某种生态型中?TGG6和TGG3为什么要发生突变?突变被自然选择所保留的生物学意义是什么?这都是今后研究必须回答的问题。 作者简介：汪萌(1981―)，女，山东聊城人，硕士研究生，主要从事生物化学和分子生物学研究；张家明(1966―)，男，湖北公安人，热带生物技术研究所研究员，博士生导师，通讯作者，主要从事作物遗传育种和分子生物学研究。
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❽ 21世纪海洋生物技术发展展望
21世纪海洋生物技术发展展望具体内容是什么，下面中达咨询为大家解答。发展展望近10年来，由于海洋在沿海国家可持续发展中的战略地位日益突出，以及人类对海洋环境特殊性和海洋生物多样性特征的认识不断深入，海洋生物资源多层面的开发利用极大地促进了海洋生物技术研究与应用的迅速发展。1989年首届国际海洋生物技术大会（以下简称MPS大会）在日本召开时仅有几十人参加，而1997年第四届IMBC大会在意大利召开时参加入数达1000多人。现在IMBC会议已成为全球海洋生物技术发展的重要标志，出现了火红的局面。《IMBC 2000》在澳大利亚刚刚开过，《IMBC 2003》的筹备工作在日本已经开始，以色列为了举办们《IMBC 2006》早早作了宣传，并争到了举办权。每3年一届的IMBC不仅吸引了众多高水平的专家学者前往展示与交流研究成果，探讨新的研究发展方向，同时也极大地推动了区域海洋生物技术研究的发展进程。在各大洲，先后成立了区域性学术交流组扒培织，如亚太海洋生物技术学会、欧洲海洋生物技术学会和泛美海洋生物技术协会等。各国还组建了一批研究中心，其中比较著名的为美国马里兰大学海洋生物技术中心、加州大学圣地亚哥分校海洋生物技术和环境中心，康州大学海洋生物技术中心，挪威贝尔根大学海洋分子生物学国际研究中心和日本海洋生物技术研究所等。这些学术组织或研究中心不断举办各种专题研讨会或工作组会议研究讨论富有区域特色的海洋生物技术问题。1998年在欧洲海洋生物技术学会、日本海洋生物技术学会和泛美海洋生物技术协会的支持下，原《海洋生物技术杂志》与《分子海洋生物学和生物技术》合刊为《海洋生物技术》学报（以下简称MB T），现在它已成为一份具有权威性的国际刊物。海洋生物技术作为一个新的学科领域已明确被定义为“海洋生命的分子生物学如细胞生物学及其它的技术应用”。为了适应这种快速发展的形势，美国、日本、澳大利亚等发达国家先后制定了国家发展计划，把海洋生物技术研究确定为21世纪优先发展领域。1996年，中国也不失时机地将海洋生物技术纳入国家高技术研究发展计划（863计划），为今后的发展打下了基础。不言而喻，迄今海洋生物技术不仅成为海洋科学与生物技术交叉发展起来的全新研究领域，同时，也是21世纪世界各国科学技术发展的重要内容并将显示出强劲的伍皮发展势头和巨大应用潜力。1.发展特点1.1加强基础生物学研究是促进海洋生物技术研究发展的重要基石海洋生物技术涉及到海洋生物的分子生物学、细胞生物学、发育生物学、生殖生物学、遗传学、生物化学、微生物学，乃至生物多样性和海春橘唯洋生态学等广泛内容，为了使其发展有一个坚实的基础，研究者非常重视相关的基础研究。在《IMBC 2000》会议期间，当本文作者询问一位资深的与会者：本次会议的主要进步是什么？他毫不犹豫的回答：分子生物学水平的研究成果增多了。事实确实如此。近期的研究成果统计表明，海洋生物技术的基础研究更侧重于分子水平的研究，如基因表达、分子克隆、基因组学、分子标记、海洋生物分子、物质活性及其化合物等。这些具有导向性的基础研究，对今后的发展将有重要影。1.2推动传统产业是海洋生物技术应用的主要方面目前，应用海洋生物技术推动海洋产业发展主要聚焦在水产养殖和海洋天然产物开发两个方面，这也是海洋生物技术研究发展势头强劲。充满活力的原因所在。在水产养殖方面，提高重要养殖种类的繁殖、发育、生长和健康状况，特别是在培育品种的优良性状、提高抗病能力方面已取得令人鼓舞的进步，如转生长激素基因鱼的培育、贝类多倍体育苗、鱼类和甲壳类性别控制、疾病检测与防治、DNA疫苗和营养增强等；在海洋天然产物开发方面，利用生物技术的最新原理和方法开发分离海洋生物的活性物质、测定分子组成和结构及生物合成方式、检验生物活性等，已明显地促进了海洋新药、酶、高分子材料、诊断试剂等新一代生物制品和化学品的产业化开发。1.3保证海洋环境可持续利用是海洋生物技术研究应用的另一个重要方面利用生物技术保护海洋环境、治理污染，使海洋生态系统生物生产过程更加有效是一个相对比较新的应用发展领域，因此，无论是从技术开发，还是产业发展的角度看，它都有巨大的潜力有待挖掘出来。目前已涉及到的研究主要包括生物修复（如生物降解和富集、固定有毒物质技术等）、防生物附着、生态毒理、环境适应和共生等。有关国家把“生物修复”作为海洋生态环境保护及其产业可持续发展的重要生物工程手段，美国和加拿大联合制定了海洋环境生物修复计划，推动该技术的应用与发展。1.4与海洋生物技术发展有关的海洋政策始终是公众关注的问题其中海洋生物技术的发展策略、海洋生物技术的专利保护、海洋生物技术对水产养殖发展的重要性、转基因种类的安全性及控制问题、海洋生物技术与生物多样性关系以及海洋环境保护等方面的政策、法规的制定与实施倍受关注。2. 重点发展领域当前，国际海洋生物技术的重点研究发展领域主要包括如下几个方面：2.1发育与生殖生物学基础弄清海洋生物胚胎发育、变态、成熟及繁殖各个环节的生理过程及其分子调控机理，不仅对于阐明海洋生物生长、发育与生殖的分子调控规律具有重要科学意义，而且对于应用生物技术手段，促进某种生物的生长发育及调控其生殖活动，提高水产养殖的质量和产量具有重要应用价值。因此，这方面的研究是近年来海洋生物技术领域的研究重点之一。主要包括：生长激素、生长因子、甲状腺激素受体、促性腺激素、促性腺激素释放激素、生长一催乳激素、渗透压调节激素、生殖抑制因子、卵母细胞最后成熟诱导因子、性别决定因子和性别特异基因等激素和调节因子的基因鉴定、克隆及表达分析，以及鱼类胚胎于细胞培养及定向分化等。2.2基因组学与基因转移随着全球性基因组计划尤其是人类基因组计划的实施，各种生物的结构基因组和功能基因组研究成为生命科学的重点研究内容，海洋生物的基因组研究，特别是功能基因组学研究自然成为海洋生物学工作者研究的新热点。目前的研究重点是对有代表性的海洋生物（包括鱼、虾、贝及病原微生物和病毒）基因组进行全序列测定，同时进行特定功能基因，如药物基因、酶基因、激素多肽基因、抗病基因和耐盐基因等的克隆和功能分析。在此基础上，基因转移作为海洋生物遗传改良、培育快速生长和抗逆优良品种的有效技术手段，已成为该领域应用技术研究发展的重点。近几年研究重点集中在目标基因筛选，如抗病基因、胰岛素样生长因子基因及绿色荧光蛋白基因等作为目标基因；大批量、高效转基因方法也是基因转移研究的重点方面，除传统的显微注射法、基因枪法和精子携带法外，目前已发展了逆转录病毒介导法，电穿孔法，转座子介导法及胚胎细胞介导法等。2.3病原生物学与免疫随着海洋环境逐渐恶化和海水养殖的规模化发展，病害问题已成为制约世界海水养殖业发展的瓶颈因子之一。开展病原生物（如细菌、病毒等）致病机理、传播途径及其与宿主之间相互作用的研究，是研制有效防治技术的基础；同时，开展海水养殖生物分子免疫学和免疫遗传学的研究，弄清海水鱼、虾、贝类的免疫机制对于培育抗病养殖品种、有效防治养殖病害的发生具有重要意义。因此，病原生物学与免疫已成为当前海洋生物技术的重点研究领域之一，重点是病原微生物致病相关基因、海洋生物抗病相关基因的筛选、克隆，海洋无脊椎动物细胞系的建立、海洋生物免疫机制的探讨、DNA疫苗研制等。2.4生物活性及其产物海洋生物活性物质的分离与利用是当今海洋生物技术的又一研究热点。现人研究表明，各种海洋生物中都广泛存在独特的化合物，用来保护自己生存于海洋中。来自不同海洋生物的活性物质在生物医学及疾病防治上显示出巨大的应用潜力，如海绵是分离天然药物的重要资源。另外，有一些海洋微生物具有耐高温或低温、耐高压、耐高盐和财低营养的功能，研究开发利用这些具特殊功能的海洋极端生物可能获得陆地上无法得到的新的天然产物，因而，对极端生物研究也成为近年来海洋生物技术研究的重点方面。这一领域的研究重点包括抗肿瘤药物、工业酶及其它特殊用途酶类、极端微生物中特定功能基因的筛选、抗微生物活性物质、抗生殖药物、免疫增强物质、抗氧化剂及产业化生产等。2.5海洋环境生物技术该领域的研究重点是海洋生物修复技术的开发与应用。生物修复技术是比生物降解含义更为广泛，又以生物降解为重点的海洋环境生物技术。其方法包括利用活有机体、或其制作产品降解污染物，减少毒性或转化为无毒产品，富集和固定有毒物质（包括重金属等），大尺度的生物修复还包括生态系统中的生态调控等。应用领域包括水产规模化养殖和工厂化养殖、石油污染、重金属污染、城市排污以及海洋其他废物（水）处理等。目前，微生物对环境反应的动力学机制、降解过程的生化机理、生物传感器、海洋微生物之间以及与其它生物之间的共生关系和互利机制，抗附着物质的分离纯化等是该领域的重要研究内容。3.前沿领域的最新研究进展3.1发育与生殖调控应用GIH（性腺抑制激素）和GSH（性腺刺激激素）等激素调控甲壳类动物成熟和繁殖的技术[1]，研究了甲状腺激素在金绍生长和发育中的调控作用，发现甲状腺激素受体mRNA水平在大脑中最高，在肌肉中最低，而在肝、肾和鳃中表达水平中等，表明甲状腺素受体在成体金银脑中起着重要作用[1]，对海鞘的同源框（Homeobox）基因进行了鉴定，分离到30个同源框基因[1]，建立了青鳉的同源框（Homeobox）基因[1]，建立了青鳉胚胎干细胞系并通过细胞移植获得了嵌合体青鳉[1]，建立了虹鳟原始生殖细胞培养物并分离出Vasa基因[2]，进行斑节对虾生殖抑制激素的分离与鉴定[2]，应用受体介导法筛选GnRH类似物，用于鱼类繁殖[2]，建立了海绵细胞培养技术，用于进行药物筛选[2]，建立了将海胆胚胎作为研究基因表达的模式系统[2]，通过基因转移开展了海胆胚胎工程的研究[2]，研究了人葡糖转移酶和大鼠已糖激酶cDNA在虹鳟胚胎中的表达［3］，建立了通过细胞周期蛋白依赖的激酶活性测定海水鱼苗细胞增殖速率的方法[3]，研究了几丁质酶基因在斑节对虾蜕皮过程中的表达［4］，从海参分离出同源框基因，并进行了序列的测定[4].3.2功能基因克隆建立了牙鲆肝脏和脾脏mRN A的表达序列标志，从深海一种耐压细菌中分离到压力调节的操纵子，从大西洋鲑分离到雌激素受体和甲状腺素受体基因，从挪威对虾中分离到性腺抑制激素基因[1]；将DNA微阵列技术在海绵细胞培养上进行了应用，构建了班节对虾遗传连锁图谱，建立了海洋红藻EST，从海星卵母细胞中分离出成熟蛋白酶体的催化亚基，初步表明硬骨头鱼类IGF-I原E一肽具有抗肿瘤作用[2]；构建了海洋酵母De—baryomyces hansenii的质粒载体，从鲤鱼血清中分离纯化出蛋白酶抑制剂，从兰蟹血细胞中分离到一种抗菌肽样物质，从红鲍分离到一种肌动蛋白启动子，发现依赖于细胞周期的激酶活性可用作海洋鱼类苗种细胞增殖的标记，克隆和定序了鳗鱼细胞色素P4501A cD-NA，通过基因转移方法分析了鳗细胞色素P450IAI基因的启动子区域，分离和克隆了鳗细胞色素P450IAI基因，建立了适宜于沟绍遗传作图的多态性EST标记，构建了黄盖鲽EST数据库并鉴定出了一些新基因，建立了班节对虾一些组织特异的EST标志，从经Hirame Rhabdovirus病毒感染的牙鲆淋巴细胞 EST中分离出596个 cDNA克隆[3]；用PCR方法克隆出一种自体受精雌雄同体鱼类的？一肌动蛋白基因，从金鲷cDNA文库中分离出多肽延伸因子EF-2CDNA克隆，在湖鳟基因组中发现了TC1样转座子元件[4]；鉴定和克隆出的基因包括：南美白对虾抗菌肽基因、牡蛎变应原（allergen）基因、大西洋鳗和大西洋鲑抗体基因、虹鳟Vasa基因、青鳉P53基因组基因、双鞭毛藻类真核启始因子5A基因、条纹鲈GtH（促性腺激素）受体cDNA、鲍肌动蛋白基因、蓝细菌丙酮酸激酶基因、鲤鱼视紫红质基因调节系列以及牙鲆溶菌酶基因等［1—4］。3.3基因转移分离克隆了大马哈鱼IGF基因及其启动子，并构建了大马哈鱼IGF（胰岛素样生长因子）基因表达载体[1].通过核定位信号因子提高了外源基因转移到斑马鱼卵的整合率[1]，建立了快速生长的转基因罗非鱼品系并进行了安全性评价；对转基因罗非鱼进行了三倍体诱导，发现三倍体转基因罗非鱼尽管生长不如转基因二倍体快，但优于未转基因的二倍体鱼，同时，转基因三倍体雌鱼是完全不育的，因而具有推广价值[2]；研究了超声处理促进外源DNA与金鲷精子结合的技术方法，将GFP作为细胞和生物中转基因表达的指示剂；表明转基因沟鲶比对照组生长快33%，且转基因鱼逃避敌害的能力较差，因而可以释放到自然界中，而不会对生态环境造成大的危害[3]；应用GFP作为遗传标记研究了斑马鱼转基因的条件优化和表达效率[3]；在抗病基因工程育种方面，构建了海洋生物抗菌肽及溶菌酶基因表达载体并进行了基因转移实验[2]；在转基因研究的种类上，目前已从经济养殖鱼类逐步扩展到养殖虾、贝类及某些观赏鱼类[2.3].通过基因枪法将外源基因转到虹鳟肌肉中获得了稳定表达[4].3.4分子标记技术与遗传多样性研究了将鱼类基因内含子作为遗传多样性评价指标的可行性，应用SSCP和定序的方法研究了大西洋和地中海几种海洋生物的遗传多样性[1].研究了南美白对虾消化酶基因的多态性[1]；利用寄生性原生动物和有毒甲藻基因组DNA的间隔区序列作标记检测环境水体中这些病原生物的污染程度，应用18S和5.8 S核糖体RNA基因之间的第一个内部间隔区（ITC—1）序列作标记进行甲壳类生物种间和种内遗传多样性研究[2]；研究了斑节对虾三个种群的线粒体DNA多态性，用PCR技术鉴定了夏威夷Gobioid苗的种类特异性。通过测定内含子序列揭示了南美白对虾的种内遗传多样性，采用同功酶、微卫星DNA及RAPD标记对褐鳟不同种群的遗传变异进行了评价，在平鱼鉴定并分离出12种微卫星DNA，在美国加州鱿鱼上发现了高度可变的微卫星DNA[3]；弄清了一种深水鱼类（Gonostoma gracile）线粒体基因组的结构，并发现了硬骨鱼类 tRNA基因重组的首个实例，测定了具有重要商业价值的海水轮虫的卫星DNA序列，用RAPD技术在大鲮鲆和鳎鱼筛选到微卫星重复片段，从多毛环节动物上分离出高度多态性的微卫星DNA，用RAPD技术研究了泰国东部泥蟹的遗传多样性[3]；用AFLP方法分析了母性遗传物质在雌核发育条纹鲈基因组中的贡献[4].3.5DNA疫苗及疾病防治构建了抗鱼类坏死病毒的 DNA疫苗[1]；开展了虹鳟IHNV DNA疫苗构建及防病的研究，表明用编码IHNV糖蛋白基因的DNA疫苗免疫虹鳟，诱导了非特异性免疫保护反应，证明DNA免疫途径在鱼类上的可行性，从虹鳟细胞系中鉴定出经干扰素可诱导的蛋白激酶[2]；建立了养殖对虾病毒病原检测的ELISA试剂盒，用PCR等分子生物学技术鉴定了虾类的病毒性病原，将鱼类的非特异性免疫指标用于海洋环境监控，研究了抗病基因转移提高鲷科鱼类抗病力的可行性，研究了蛤类唾液酸凝集素的抗菌防御反映[2]；研究了一种海洋生物多糖及其衍生物的抗病毒活性[3]；建立了测定牡蛎病原的PCR—ELISA方法[3]；研究了Latrunculin B毒素在红海绵体内的免疫定位[4].3.6生物活性物质从海藻中分离出新的抗氧化剂[1]，建立了大量生产生物活性化合物的海藻细胞和组织培养技术，建立了通过海绵细胞体外培养制备抗肿瘤化合物的方法[1]；从不同生物（如对虾和细菌）中鉴定分离出抗微生物肽及其基因，从鱼类水解产物中分离出可用作微生物生长底物的活性物质，海洋生物中存在的抗附着活性物质，用血管生成抑制剂作为抗受孕剂，从蟹和虾体内提取免疫激活剂，从海洋藻类和蓝细菌中纯化光细菌致死化合物，海星抽提物在小鼠上表现出批精细胞形成的作用，从海洋植物Zostera marina分离出一种无毒的抗附着活性化合物，从海绵和海鞘抽提物分离出抗肿瘤化合物，开发了珊瑚变态天然诱导剂，从海胆中分离出一种抗氧化的新药，在海洋双鞭毛藻类植物中鉴定出长碳链高度不饱和脂肪酸（C28），表明海洋真菌是分离抗微生物肽等生物活性化合物的理想来源[2]；发现海洋假单胞杆菌的硫酸多糖及其衍生物具有抗病毒活性，从硬壳蛤分离出谷光甘肽一S一转移酶，从鲤血清中分离出丝氨酸蛋白酶抑制剂，从海绵中分离出氨激脯氨酸二肽酶，从一种珊瑚分离出具DNA酶样活性的物质，建立了开放式海绵养殖系统，为生物活性物质的大量制备提供了充足的海绵原料[3]；从虾肌水解产物中分离到抗氧化肽物质[4]；3.7生物修复、极端微生物及防附着研究了转重金属硫蛋白基因藻类对海水环境中重金属的吸附能力，表明明显大于野生藻类[1]，研究了石油降解微生物在修复被石油污染的海水环境上的可疗性及应用潜力[1]；研究了海洋磁细菌在去除和回收海水环境中重金属上的应用潜力[1]；用Bacillus清除养鱼场污水中的氮，用分子技术筛选作为海水养殖饵料的微藻，开发了六价铬在生物修复上的应用潜力，分离出耐冷的癸烷降解细菌，研究了海洋环境中多芳香化烃的微生物降解技术[2]；从噬盐细菌分离出渗透压调节基因，并生产了重组Ectoine（渗透压调节因子），从2650米的深海分离到一种耐高温的细菌，这种细菌可用来分离耐高温和热稳定的酶，在耐高温的archaea发现了D型氨基酸和无氧氨酸消旋酶，测定了3种海洋火球菌的基因组DNA序列，借助于CROSS／BLAST分析进行了特定功能基因的筛选，从海底沉积物、海水和北冰洋收集了1000多种噬冷细菌，并从这些细菌中分离到多种冷适应的酶[2]；建立了一种测定藤壶附着诱导物质的简单方法，研究了Chlorophyta和共生细菌之间附着所必需的形态上相互作用，研究了珊瑚抗附着物质（dterpene）类似物的抗附着和麻醉作用[3]；分析了海岸环境中污着的起始过程，并对沉积物和附着物的影响进行了检测[4].4.展望与建议上述研究分析表明，海洋生物技术作为一个全新的学科，已成为21世纪海洋研究开发的重要领域，并沿着三个应用方向迅速发展。一是水产养殖，其目标十分清楚就是要提升传统产业，促使水产养殖业在优良品种培育、病害防治、规模化生产等诸多方面出现跨越式的发展；二是海洋天然产物开发，其目标是探索开发高附加值的海洋新资源，促进海洋新药、高分子材料和功能特殊的海洋生物活性物质产业化开发；三是海洋环境保护，其目标是保证海洋环境的可持续利用和产业的可持续发展。令人可喜的是这个应用发展趋势与我国海洋产业的发展需求，特别是与我国海洋生物资源可持续开发利用的高技术需求相一致[5].事实上，在过去5年中我国海洋生物技术的研究应用已经取得了长足的进步，取得了一批具世界先进水平的研究成果，在推动海洋产业发展中发挥了重要作用。进入21世纪，加大海洋863的支持力度，进一步促进我国海洋生物技术快速发展的势头，不仅有现实的意义，也是具有战略价值的举措。另外，面对科技全球化的挑战，多渠道地加强国际合作与交流，促进我国海洋生物技术创新和产业化向更高层面上发展也是十分重要的。从技术应用的角度看，海洋生物技术主要是利用海洋环境特殊性和生物多样性特征，从分子和细胞水平上，即从高技术水平上多层面地开发利用海洋生物群体资源。遗传资源和天然产物资源，那么与此相关的基础研究就显得十分重要了。事实上，这也是一种国际研究发展趋势。为了弥补这方面的不足，在我国海洋生物技术发展过程中需要有多方面支持和配合，不仅要与《国家重点基础研究发展规划》、《国家自然科学基金》等相关计划沟通、衔接，还需要加强基础性建设。既需要加强中试基地和产业化基地建设，也需要加强基础设施建设，如加强开放实验室、研究基地、生物多样性资源库、种子库、信息数据库的建设。这些措施对我国海洋生物技术向更高水平发展具有深远意义。更多关于工程/服务/采购类的标书代写制作，提升中标率，您可以点击底部官网客服免费咨询：https://bid.lcyff.com/#/?source=bdzd
